筋肉は、異なる機能や特徴を持つ筋線維から構成されています。
例えば、眼球を動かす外眼筋と、腕や脚を動かす四肢筋では、筋線維の構成や神経支配の仕組みが異なります。
こうした筋線維の違いを遺伝子レベルで調べる場合、筋肉全体からRNAを抽出する方法では、異なる筋線維の情報が混ざってしまうことがあります。
そこで役立つのが、**レーザーマイクロダイセクション（Laser Capture Microdissection：LCM）**です。
今回は、米国LAXCO社のアプリケーションノート「Laser Capture Microdissection of Muscle Fiber Populations and Expression Analysis by RT-PCR」をもとに、Accuva Cellectを使用して特定の筋線維を選択的に回収し、遺伝子発現を解析した研究事例をご紹介します。
筋線維の種類によって何が違うのか？
骨格筋は、多数の筋線維から構成されています。
筋線維には速筋や遅筋などの分類がありますが、今回の研究では、神経と筋線維の接続様式に注目しています。
研究対象となったのは、次の2種類です。
SIF：単一神経支配筋線維
SIF（Singly Innervated Fiber）は、1本の筋線維に神経筋接合部が1か所存在するタイプです。
資料によると、四肢筋の筋線維はSIFであり、外眼筋でも約80％がこのタイプに分類されます。
MIF：多重神経支配筋線維
MIF（Multiply Innervated Fiber）は、1本の筋線維に複数の神経筋接合部が存在するタイプです。
外眼筋では、約20％の筋線維がMIFに分類されます。
外眼筋にはSIFとMIFが混在しているため、筋肉全体をまとめて解析すると、筋線維ごとの遺伝子発現の違いを明確にすることが難しくなります。
レーザーマイクロダイセクション（LCM）とは？
LCMは、顕微鏡で組織切片を観察しながら、目的の細胞や組織領域を選択的に回収する技術です。
組織全体を採取する方法とは異なり、特定の細胞集団を選んで回収できるため、異なる細胞が混在する試料の解析に役立ちます。
今回の研究では、LCMによってSIFとMIFを区別して回収し、それぞれの筋線維における遺伝子発現を調べています。
実験方法①：筋肉の組織切片を作製
研究では、四肢筋と外眼筋を採取し、OCTコンパウンドで包埋して凍結しました。
その後、クライオスタットを使用して厚さ10 µmの凍結組織切片を作製しています。
作製した切片は、RNAの品質を維持するために低温で保存されました。
実験方法②：2種類の染色で筋線維を識別
今回の研究で重要なのは、筋線維を回収する前に、目的の筋線維を正確に見分けることです。
研究者は、2種類の染色方法を組み合わせています。
アセチルコリンエステラーゼ染色
神経筋接合部の形態を確認するための染色です。
SIFでは比較的大きなC字型の神経筋接合部が、MIFでは小さく円形に近い神経筋接合部が観察されます。
slow MyHC免疫蛍光染色
slow MyHC（遅筋型ミオシン重鎖）を検出するための免疫蛍光染色です。
今回の研究対象では、SIFはslow MyHC陰性、MIFはslow MyHC陽性でした。
これら2種類の染色を組み合わせることで、目的の筋線維を識別しています。
実験方法③：Accuva Cellectによる筋線維の回収
染色後、蛍光観察機能を備えたAccuva Cellectを使用して、目的の筋線維を回収しました。
レーザー照射サイズは7 µmに設定され、個々の筋線維を選択して回収できる条件が使用されています。
回収した細胞は専用キャップに捕捉され、顕微鏡で確認されました。
また、目的外の組織が混入していないかを確認し、不要な組織が認められたキャップは使用しないなど、試料の選択性を重視した手順が採用されています。
組織内の特定の筋線維を選び、目的外の組織の混入を抑えて回収できることが、LCMの重要な特徴です。
実験方法④：RNA抽出とRT-PCRによる解析
回収した筋線維は、各集団について約25本をまとめてRNA抽出に使用しました。
RNA抽出にはPicoPure RNA Isolation Kitを使用し、得られたRNAをRiboAmp RNA Amplification Kitによって増幅しました。
RNA増幅後には、通常300～600 ngの増幅RNA（aRNA）が得られています。
その後、cDNAを作製し、RT-PCRによって筋特異的遺伝子の発現を解析しました。
主な解析対象は以下のとおりです。
| 遺伝子 | 主な役割 |
|---|---|
| slow MyHC | 筋線維の収縮特性に関連 |
| アセチルコリン受容体εサブユニット | 神経筋接合部における信号伝達に関連 |
| アセチルコリン受容体γサブユニット | 神経筋接合部における信号伝達に関連 |
| GAPDH | PCR解析の参照遺伝子 |
実験結果：筋線維の種類ごとに遺伝子発現を解析
今回のアプリケーションノートでは、LCMによって特定の筋線維や筋線維集団を選択的に回収し、RT-PCRによって筋特異的遺伝子の発現を解析できたことが報告されています。
また、異なる筋線維集団の間で遺伝子発現パターンに違いが認められました。
この結果は、筋肉全体をまとめて解析するのではなく、筋線維の種類ごとに分けて解析することの有用性を示しています。
なお、資料には遺伝子ごとの詳細な発現倍率や統計解析結果は掲載されていないため、本記事では定量的な発現差については示していません。
RNA品質を維持するための工夫
LCMによる遺伝子発現解析では、目的の細胞を正確に回収するだけでなく、RNAの分解を防ぐことが重要です。
RNAは分解されやすく、組織切片の染色や洗浄に時間をかけすぎると、解析に影響する可能性があります。
今回の研究では、アセチルコリンエステラーゼ染色と免疫蛍光染色を組み合わせた迅速なプロトコルを採用しています。
スライドの解凍から脱水までの時間を32分に短縮し、RNAの分解を抑える工夫が行われました。
このように、LCMを用いたRNA解析では、組織の保存、染色、回収、RNA抽出までの工程全体を適切に設計することが重要です。
筋疾患・神経筋研究への応用可能性
今回の研究は、筋線維の種類ごとに分子特性を調べるためのLCMの有用性を示しています。
このような技術は、以下の研究分野でも活用が考えられます。
・筋ジストロフィーなどの筋疾患研究
・サルコペニアや筋萎縮に関する研究
・神経筋接合部の機能研究
・筋再生・組織修復研究
・筋線維タイプ別の遺伝子発現解析
・外眼筋の機能や分化に関する研究
ただし、これらはLCM技術の応用が考えられる研究分野であり、今回の資料ですべての疾患への適用が実証されたものではありません。
Accuva Cellectによる細胞・組織の選択的回収
米国LAXCO社のAccuva Cellectは、レーザーを使用して目的の細胞や組織領域を選択的に回収するシステムです。
蛍光観察に対応した構成も用意されており、蛍光標識によって識別した細胞や組織の回収にも利用できます。
今回の研究のように、免疫蛍光染色によって目的の筋線維を識別し、LCMで回収した後、RNA解析につなげるワークフローに活用できます。
まとめ
今回の研究では、外眼筋と四肢筋に存在する筋線維を染色によって識別し、Accuva Cellectを使用して選択的に回収しました。
さらに、回収した筋線維からRNAを抽出し、RT-PCRによって筋特異的遺伝子の発現を解析しています。
この研究から、組織内に混在する異なる筋線維を分けて回収し、それぞれの分子特性を調べられるというLCMの有用性が示されました。
Accuva Cellectは、筋肉研究をはじめ、病理学、神経科学、分子生物学などの研究において、目的細胞や組織領域の選択的回収を支援する装置です。
株式会社インミディアムでは、Accuva Cellectの製品仕様、新規導入、既存LCM装置からの更新についてご相談を承っています。
製品名：Accuva Cellect
製造元：LAXCO, Inc.（米国）
日本国内取扱い：株式会社インミディアム
ホームページ：https://www.inmediam.com
参考資料
LAXCO, Inc.
Laser Capture Microdissection of Muscle Fiber Populations and Expression Analysis by RT-PCR.
Application Note #2. © 2024 LAXCO Inc.
※本記事はLAXCO社のアプリケーションノートをもとに作成しています。掲載した研究結果は当該実験条件で得られたものであり、すべての試料で同等の結果が得られることを保証するものではありません。
※Accuva Cellectは研究用機器です。